大豆下胚轴再生体系的优化及HaBADH转化的初步研究

【摘要】大豆是重要的油料作物之一,也是植物蛋白的重要来源,已在全国广泛种植。在农业生产中,大豆常受到非生物胁迫因子的影响,如干旱、高盐、低温等,导致质量下降与产量降低。作为对盐分中度敏感的作物,大豆耐盐性较差,因此,通过转基因方法,提高大豆耐盐性,获得耐盐大豆品种,以充分利用沿海地区不断扩大的盐碱化土地具有重大的意义。然而,与其他作物相比,大豆组织培养体系存在着植株再生频率较低、基因型依赖性强、重复性差等的诸多缺陷,导致其在遗传转化操作技术上难度大,遗传转化率低,这些问题都亟待解决与提高。本文研究大豆基因型、植物激素、诱导时间等因素对大豆下胚轴不定芽形成的影响,以优化大豆下胚轴再生体系；利用农杆菌介导法转化HaBADH(向日葵甜菜碱醛脱氢酶基因),探讨大豆基因型、抗性筛选剂种类等对大豆下胚轴遗传转化的影响,进一步优化大豆下胚轴农杆菌介导遗传转化体系,以期为用转基因技术改良大豆品种抗逆性奠定实验基础。甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是合成甜菜碱的关键酶,在受到盐胁迫时,甜菜碱不仅起着无毒渗透保护剂的作用,而且它能保护细胞内蛋白质和酶类的活性,从而提高植物的抗旱、耐盐能力。本研究主要结果如下：1.大豆下胚轴的不定芽诱导率在8个不同基因型(黑农44、黑农37、黑农35、合丰35、吉育91、淮豆4号、淮豆9号、绥农28)之间的差异较大,变幅为15.63%～87.50%,其中淮豆9号和合丰35的不定芽诱导率相对较高,分别为87.50%和84.72%,其均极显著地高于大豆下胚轴研究常用的基因型黑农44(对照基因型),后续试验将以合丰35、淮豆9号和黑农44为试验材料。2.培养基中IBA和6-BA的浓度及两者比值直接影响着不定芽的诱导和生长,试验以黑农44为试验材料,筛选结果为,萌发培养基6-BA浓度为1.0mg/L,诱导培养基IBA浓度为0.1mg/L时,其不定芽诱导率最快达到100.00%,且芽数(≥0.5cm)和芽长也较好,分别为2.53个和2.61cm。此激素浓度条件下,诱导9d和11d的芽长均极显著地高于其他3个诱导时间(3、5、7d)下的芽长。3.本试验农杆菌转化后采用的筛选剂为卡那霉素和NaCl,脱菌剂为头孢霉素,研究3个基因型大豆下胚轴卡那霉素敏感浓度分别是淮豆9号和黑农44为100mg/L合丰35为150mg/L;下胚轴NaCl耐性分别是黑农44和合丰35为100mmol/L,淮豆9号为75mmol/L;敏感浓度下大豆下胚轴的不定芽诱导率、芽数及芽长均显著性地低于对照,以上筛选出的卡那霉素和NaCl浓度是大豆下胚轴遗传转化时的筛选浓度。4.以合丰35、淮豆9号和黑农44为试验材料,利用农杆菌介导法进行HaBADH基因的遗传转化,合丰35和黑农44的不定芽诱导率均显著性地高于淮豆9号。因此,大豆下胚轴遗传转化时,合丰35和黑农44比淮豆9号更适于作为转化的受体材料。5.合丰35和黑农44下胚轴转化后,分别经100mg/L和150mg/L卡那霉素或75mmol/LNaCl筛选,获得的抗性苗PCR阳性率在29.75%～61.76%之间。比较两种筛选剂的筛选效果,发现以NaCl为筛选剂时的PCR阳性率(黑农44：47.37%、合丰35：61.76%)均高于以卡那霉素为筛选剂时的PCR阳性率(黑农44：36.26%、合丰35：29.75%)。因此,NaCl可能更适于作为大豆下胚轴遗传转化时的筛选剂,但本试验中NaCl筛选浓度可能过高,严重抑制下胚轴不定芽的生长,导致抗性不定芽难以存活,后期研究中可以适当降低NaCl的筛选浓度。
【作者】郭秋云；
【导师】王萍；刘兆普；
【作者基本信息】南京农业大学，海洋生物学，2013，硕士
【关键词】大豆；下胚轴；农杆菌；遗传转化；BADH；

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